大鼠骨折模型是常用的动物实验模型，目前常用X-射线摄影的医学影像学方法记录和评价模型的形成和愈后等情况［1，2］。但因为大鼠的骨骼偏小，X-射线摄像的清晰度、分辨率均不太理想，且为二维图像无法反映其三维特征，甚至影响了对实验结果的判断和评价。随着医学影像技术的不断发展，CT、MRI等影像技术在医学诊断中得到了广泛的应用。笔者在实验工作中尝试运用CT扫描四维成像技术和核磁共振影像技术对大鼠骨折模型进行了影像学评价，与X-射线摄像技术进行了比较，并用临床上广为应用的治疗药物伤科接骨片对大鼠模型进行治疗后，对骨折恢复的重要环节进行了多方位的综合评价，为先进科学技术在动物实验中的应用进行了探索性研究。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重(雌性250～270 g，雄性260～280 g)，上海斯莱克实验动物有限公司提供［SCXK(沪)2012-0002］;实验在本院SPF级屏障环境动物实验室进行［SYXK(苏) 2011-0015］，并遵循实验动物使用的“3R”原则，给予人道主义的关怀。 1.1.2 主要仪器和试剂 Mammomat-1000 NOVA型摄影X射线机:Siemens公司(德国);Lightspeed VCT XT型64排螺旋CT:GE公司(美国);Echospeed型1.5T超导核磁共振仪:GE公司(MRI，美国);Axioskope 2型显微图象分析系统:Zeiss公司(德国);伤科接骨片:0.36 g/片，大连美罗中药厂有限公司(中国);钙、磷测定试剂盒:南京建成生物工程研究所(中国)。 1.2 方法 1.2.1 实验动物分组 大鼠购进后适应性饲养1周，取60只称重后按性别、体重随机分为3组:假手术组、模型组，伤科接骨片治疗组，每组各20只，雌雄各半，做好标记，分笼饲养，每周复称体重。 1.2.2 动物模型的制备 将模型组，治疗组大鼠按文献［1］方法制备前右肢桡骨中段骨折模型:水合氯醛腹腔注射麻醉，右前臂脱毛，于右前臂前侧作直切口，切开皮肤及深筋膜，从拇展长肌及桡侧腕长伸肌之间分离，骨膜外暴露桡骨，在双侧桡骨中段以骨钳折断，滴入3～4滴的青霉素液(40万U/mL)预防感染，然后逐层缝合，后肢连续3d肌注青霉素(40万U/只)预防感染。手术3 d后开始按组分别灌胃给药，方法如下:治疗组将伤科接骨片用蒸馏水配制成浓度为0.033 g/mL的混悬液，按0.33 g/kg的剂量灌胃给药，假手术组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水。各组每日灌胃给药一次，共4周，在本院SPF动物实验室正常喂养。 1.2.3 放射影像学检查(X射线、MRI和CT成像检查) 给药第28天，各组取10只大鼠(雌雄各5只)分别以3.5%浓度的水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉后，分别进行X射线、核磁共振(MRI)和计算机扫描CT四维成像等放射影像学检查，检查各大鼠骨折部位的愈合和恢复情况，并参考文献方法［1］进行4级评分。评分标准:1分，骨折断面可见或边缘趋向性模糊，未见骨膜和骨痂形成;2分，断面边缘模糊、不整齐，可见骨膜形成，少量骨痂形成;3分，断面边缘接近消失，骨膜明显，骨痂量增多但尚未填满;4分，断面边缘消失，骨膜近似正常，骨痂填满，与骨皮质相互连接。 1.2.4 血液和骨折部位检测标本的获取 给药四周后，每组各取10只大鼠(雌雄各5只)，分别以水合氯醛麻醉后，腹主动脉抽取血液，约3 mL以15%EDTA抗凝，测定血小板聚集率、全血粘度(高切、中切、低切的切变率分别为8、40、120 1/s)及血浆粘度，其余置于未加抗凝剂试管中，室温放置60 min，3000 r/min离心5 min，取血清按试剂盒说明书的方法测定血清Ca、P的水平。 第28天取血后，离断大鼠腕肘关节，剔除附着的软组织，取完整左侧挠骨，将骨痂组织标本置于装有4%甲醛(pH 7.4)的洁净玻璃瓶中封口，置于4℃冰箱中，固定48 h再将骨痂标本置于含5%EDTA(乙二胺四乙酸)液中脱钙30 d左右。石蜡包埋，常规切片(矢状面)，行HE染色，光学显微镜下观察骨痂生长情况。 1.2.5 生物力学特征—抗折力测试 给药结束后，每组另取10只大鼠(雌雄各5只)，按上法解剖取完整的挠骨标本，然后将获取的挠骨架在两根铁棒之间，以桡骨骨折处为中心挂一根线绳，在线绳下端悬挂一个小桶，然后逐渐向小桶内加水，当水加到一定的重量时，该愈合的骨头就会 发生折断，然后称量小桶中所加的水的重量作为桡骨骨折造模抗折力的指标。 1.2.6 数据处理 各实验检测结果以SPSS 13.0软件进行方差分析和组间t-检验统计学分析。 2 实验结果 2.1 大鼠骨折部位的X射线检查结果 X射线检查结果表明:伪手术组大鼠的右前肢桡骨轮廓清晰、光滑，结构完整，未见明显创伤。模型组大鼠的右前肢桡骨可见明显的创伤性骨折，为横断的完全骨折，多数有明显的错位，可见纤维性骨痂形成，但骨折线明显可见。治疗组给药后骨折部位可见有明显的致密性骨痂形成，骨折线模糊不清或消失，多数可见大量的钙盐沉积，趋于愈合(见图1)。 2.2 大鼠骨折部位的CT成像、MRI检查结果 骨折部位的CT成像、MRI检查结果基本与X射线检查结果基本一致，但CT成像更直观地反应了骨折部位的外膜轮廓愈合和恢复情况，且图像直观、清晰，可以从不同的角度和侧面反映骨折部位的愈合情况(见图2)。而MRI图谱则更加清晰地反应了骨折部位内部的恢复情况，但图像清晰度稍差(见图3)。 图1 骨折大鼠X-射线图Fig.1 X-ray pictures of the fracture rats注:A图为伪手术组1号大鼠;B图为模型组3号大鼠;C图为治疗组6号大鼠 A is the No.1 rat of sham group.B is the No.3 rat of model group.C is the No.6 rat of therapy group. 图2 骨折大鼠CT成像图(注:大鼠的编号同图1)Fig.2 CT images of the fracture rats(The number of rat is the same in Fig.1 ) 图3 骨折大鼠MRI成像图(注:大鼠的编号同图1)Fig.3 MRI images of the fracture rats(The number of rat is the same in Fig.1 ) 2.3 对骨折部位的影像学评分结果 表1可见，治疗组的影像学评分明显高于模型组，表明其愈合情况明显好于模型组。伪手术组因为没有骨折造模，全部分4分(见表1)。 表1 治疗后影像学评分结果(，n=10)Tab.1 Imaging scores after drug treatment注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0. with the sham group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01.平均积分Average integral伪手术组Sham4.＊＊模型组Model2.治疗组Therapy3.组别Groups＊＊ 2.4 对大鼠全血及血浆粘度的影响 表2可见，与模型组比较，治疗量组全血粘度(高切，中切，低切)有明显的降低，差异有显著性(P＜0.01)，表明伤科片对骨折模型大鼠全血粘度的升高有一定的降低作用，对血浆粘度的升高其抑制作用不明显(P＞0.05，见表2)。 表2 对骨折模型大鼠全血粘度及血浆粘度的作用(，n=10)Tab.2 Effect on whole blood and plasma viscosity in the fracture rats注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0. with the sham group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01.组别Groups血浆粘度低切Low shear rate (8 1/s)全血粘度Whole blood viscosity(m Pa.s)中切Moderate shear rate (40 1/s)高切High shear rate (120 1/s)(m Pa.s)伪手术组Sham9.＊＊5.＊＊3.＊＊0.＊＊1.模型组Model16.治疗组Therapy12.＊＊6.＊＊4.＊＊ 2.5 对大鼠血小板聚集率的影响 表3可见，与模型组和伪手术组比较，治疗组血小板聚集率明显降低，有极显著意义(P＜0.01)，表明伤科接骨片可抑制血小板聚集，有明显的活血作用。在实验过程中，模型组有2只血液标本有凝聚血丝，不能正常测定，故n=8(见表3)。 表3 对骨折模型大鼠血小板聚集率的影响()Tab.3 Effect on platelet aggregation in the fracture rats注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0. with the sham group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01.血小板聚集率/% Platelet aggregation rate伪手术组Sham1050.模型组Model859.治疗组Therapy1024.组别Groups标本数/只Samples＊＊ 2.6 对骨折模型大鼠血清Ca，P水平的影响 与模型组比较，治疗组大鼠的血清Ca、P水平均有明显升高(P＜0.05～0.01);甚至略高于伪手术(正常对照)组的水平，表明服用伤科接骨片后可以促进Ca、P的吸收，有益于骨折创伤的恢复(见表4)。 表4 对骨折模型大鼠血清Ca，P水平的影响(，n =10)Tab.4 Effect on the serum Ca and P levels in the rats注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0. with the sham group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01.组别GroupsCa/mmol/LP/mmol/L伪手术组Sham2.模型组Model1.治疗组Therapy2.*2.＊＊ 2.7 骨折部位生物力学检测——抗折力测试结果 实验结果表明，模型组大鼠骨折部位的抗折力显著下降，给药各组的抗折力比模型组均明显提高(P＜0.05～0.01)，高、中剂量组的愈合情况尤佳，但仍未恢复到正常动物的水平(见表5)。 表5 大鼠骨折部位抗折力测试结果(，n=10)Tab.5 Anti-rupture strength of the fracture site of rats注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0. with the sham group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01.折断骨折部位的重量/g Weight used to the fracture site伪手术组Sham1480.＊＊模型组Model496.治疗组Therapy874.组别Groups＊＊ 2.8 对骨折部位的病理组织学检查结果 病理组织学检查结果提示:伪手术组大鼠的右前肢桡骨的病理切片可见骨密质呈板层状，骨结构完整，骨髓腔清晰，骨皮质连续，骨小梁排列整齐，骨组织无缺损，结构正常。造模各组大鼠骨折部位的骨髓腔均消失，其中模型组以纤维骨痂为多，可见大片的纤维性骨痂和少量的骨小梁残留;治疗组大鼠可见骨性和软骨骨痂形成，多数骨小梁长成且排列较齐，仅有2只大鼠的骨小梁排列稍乱，骨折的愈合情况明显好于模型组(见图4)。 3 小结与讨论 图4 骨折大鼠的病理组织切片图 group:bone callus formation，some are cartilage callus，and bone trabecular formation regularly Histopathological changes in the bones of fracture rats 骨折是临床上多见的创伤性疾病，其愈合过程是复杂的骨组织结构和生物力学不断恢复的过程［3］。在骨折初时，因骨骼及周围组织血管断裂、出血而在局部形成瘀肿，并逐渐形成含有网状纤维素的凝块，约24 h后新生毛细血管、成纤维细胞和吞噬细胞开始侵入，使血肿块机化，被机化的血肿块和肉芽组织再演变为纤维结缔组织，形成骨折端的纤维化愈合［4］。其后骨折部位的骨内膜及骨外膜的成骨和成软骨细胞开始发生，产生骨化组织，填充在骨折端的空隙，形成内、外骨痂，并沿着骨皮质的髓腔侧和骨膜侧向骨折线生长，逐步会合并不断钙化。骨折间隙早期形成的纤维组织也逐步转化成软 骨组织，进而钙化成骨痂，同时新生的骨小梁不断增加，骨痂也逐步骨化形成骨连接，终至骨折愈合［5，6］。实验中选择的治疗药“伤科接骨片”由红花、炙没药、三七、煅自然铜、马钱子粉、炙乳香、土鳖虫、冰片等中药精制成，有“活血化瘀，消肿止痛，舒筋接骨”的功效，是临床上常用的治疗骨折的中成药。其中的红花、没药、三七、冰片等活血化瘀中药在骨折早期可发挥化瘀、消肿、止痛的作用，而煅自然铜、乳香、土鳖虫等中药则对其后的骨痂形成及骨化、骨小梁生成等有一定的促进作用。实验研究结果进一步确证了其主要功效，表明伤科接骨片口服给药后可促进骨折模型大鼠的创口形成骨性和软骨性骨痂，促进骨小梁的生成和钙盐沉积，使愈合后的骨折部位的生物力学特征——抗折力明显增强，进而加速其愈合。这些药效作用可能与全方的活血通络、促进骨折断端钙磷的沉积和纤维骨痂组织的钙化等有关，其作用的机理有待进一步地研究和分析。 通过对大鼠骨折模型的X-射线、CT四维成像和MRI图像的比较，发现X-射线图为二维图像，远不及CT成像对大鼠骨折及愈合情况表达的清晰、直观和全方位。而MRI图像需要用特殊的动物专用小线圈，价格昂贵，目前难以推广，且其图像的清晰度、分辨率和直观表达也需要进一步地提升。CT四维成像是先将X线束对物体扫描后，由探测器接收透过该层面的X线，转变为可见光，由光电转换器转变为电信号，再经模拟/数字转换器转为数字信号，输入计算机进行处理，最终形成清晰的全方位四维动画图像，从而更加清晰、直观地反映骨折的愈合情况，值得进一步地推广应用。当然，CT四维成像可能对愈合期骨痂和成骨的区分不够清晰，有文献报道［4］正常的骨痂CT阈值约在225～330之间，而成熟骨组织的CT值则在331～700之间，因此可以运用多阈值分析法分别对骨痂和成熟骨组织进行表达。另外，也需结合生物力学、病理组织学等检查综合评价骨折的修复情况。